细菌分离培养是兔场实验室诊断工作中一个十分重要的步骤，通过对细菌的分离和纯培养，可以根据菌落的形态、大小、结构、色泽、气味以及有无溶血等情况进行初步鉴定，然后通过进一步的染色镜检或者是特殊培养进行鉴定或研究，为病原的确诊提供依据。

1．培养基制备培养基是细菌学检查过程中非常重要的材料，它含有细菌生长所必需的营养物质，细菌经过培养基的纯培养，才能够进行准确的检查，得到可靠的结果。

(1)肉水的制作：

①材料：瘦牛肉500克，蒸馏水(或常水)1000毫升。

②方法：取瘦牛肉除去脂肪、肌腱，切成碎块或绞碎，按1千克牛肉2千毫升水的比例，加水浸泡一夜，煮沸一小时，用纱布初步滤去肉渣挤出肉水，再用滤纸滤过，补足原有水量，装入烧瓶中置高压灭菌器中120℃20分钟灭菌，制成肉水。

制作肉水的另一种方法是：取牛肉浸膏0.5-1.0克，加蒸馏水100毫升，加热溶解，滤纸滤过，并同上述方法进行灭菌即成。

③用途：制作各种培养基的基础。

(2)营养肉汤：

①材料：肉水1000毫升，蛋白胨IO克，氯化钠5克。

②方法：将蛋白胨和氯化钠加入肉水中，稍加热溶解，用氢氧化钠溶液调整pH值为7.4-7.6之间，再加温使溶液均匀。滤过分装后高压灭菌备用。

③用途：可供一般的细菌生长需要，检查细菌的生长表现，也可作为制作固体培养基的基础。

(3)营养琼脂：

①材料：营养琼脂粉40克，蒸馏水1000毫升。

②方法：将营养琼脂粉加入蒸馏水中，搅拌浸泡1小时，加热使充分溶解，高压灭菌备用。

③用途：分离细菌纯培养及作为其他特种培养基的基础。

(4)血液琼脂培养基：

①材料：脱纤维血5-10毫升，营养琼脂100毫升。

②方法：准备好灭菌并有玻璃珠的三角烧瓶，无菌采集血液，注入三角烧瓶中，不停地摇动，直至血纤维分离为止，一般需要10分钟。

高压灭菌好的营养琼脂融化后，冷却至55-60℃时加人脱纤维血液，注意必须确保无菌操作，加入血液后轻轻摇动，不使产生气泡，立即倒人无菌平皿或分装于灭菌试管中备用。

③用途：观察细菌的溶血情况，有些细菌的初次分离时需要此种培养基。

(5)厌氧肝片肉汤：

①材料：营养肉汤，动物肝块或肉渣，液体石蜡。

②方法：利用作肉汤的碎肉块、肉渣或者是动物肝脏少许，分装于试管中加营养肉汤5毫升，上层加液体石蜡0.5-1.0毫升．120℃20分钟灭菌备用。

③用途：厌氧菌的培养。

(6)麦康凯琼脂：

①材料：麦康凯琼脂粉38克，蒸馏水1000毫升。

②方法：将麦康凯琼脂粉加入蒸馏水中，搅拌浸泡l小时，加热使充分溶解，高压灭菌备用。

③用途：常用作大肠杆菌类细菌的分离培养。

2．细菌接种方法

(1)平板划线接种法：平板划线接种法是细菌分离培养中最常用的方法，能使细菌分散生长，形成单个菌落。左手持培养皿，用拇指、食指及中指将平皿揭开，角度不要超过20度，右手拿接种环，接种环与琼脂表面约呈45度角。取少许病料涂布于培养基边缘，火焰灭菌接种环，冷却后轻触培养基边缘的病料区，并向一边划出横线，可以连续划出一个小区，火焰灭菌接种环，冷却后将平皿转换角度，从第一个小区再向外划出一个小区，以后再按照同样方法分区将平板划满，注意只能在起始部位与前一个小区交叉。

(2)琼脂斜面接种法：本方法多用于菌种的保存，也可以用于细菌的分离。左手持斜面培养基，右手持接种环，火焰灭菌冷却后挑取所需的菌落，以右手小拇指夹住棉塞或胶塞，轻转后取出，注意不要污染，立即将管口和塞子火焰灭菌，将接种环伸入试管内，自斜面底部向管口方向划曲线，再经火焰消毒管口和塞子后盖严，进行培养。

(3)穿刺接种法：本法适用于半固体、固体培养基以及微量发酵管的接种，用来做细菌的生化和动力学实验。沿培养管中心直刺至距管底约0.5厘米处，然后再沿穿刺线退出接种针。

(4)液体培养基接种法：方法基本同斜面接种法，将接种环在培养管壁的液面下摩擦，然后再在液体中振动几次，塞好塞子。注意塞子和管口的灭菌操作。

3．细菌培养方法

细菌的培养方法根据细菌的生长特性、培养目的、要求等不同而不同。主要分为以下几种：

(1)需氧培养法：即一般培养法。细菌接种培养基后，置于37℃培养箱内培养即可。适用于需氧菌及兼性厌氧菌的分离培养。

(2)二氧化碳培养法：某些细菌要在一定的二氧化碳环境中才能良好生长。

①烛缸法：将接种的培养基置于干燥器内，点燃蜡烛后，密封好，连同容器一起置温箱中培养。

②化学法：每升容器中按照碳酸氢钠0.4克，盐酸3.5毫升的比例，分别装入两个小容器中，置于干燥器中，密封后使两药接触产生二氧化碳。

③二氧化碳培养箱法：将培养基置于特制的二氧化碳培养箱中培养，可以根据需要调节二氧化碳的浓度。

(3)厌氧培养法：

①换气法：将培养基放入干燥器内，将干燥器内抽成真空，然后充入氮气、氢气和二氧化碳的混合气体，放人温箱中培养。

②焦性没食子酸法：焦性没食子酸在碱性溶液中形成焦性没食子酸盐，可以吸收空气中的氧气，从而造成无氧的环境，适合厌氧菌生长。培养方法：将平皿去盖翻转，放置焦性没食子酸1克，再覆上一层脱脂棉，在脱脂棉上滴加IO%的氢氧化钠1毫升，然后将接种好的平皿覆盖在翻转的盖上，迅速用蜡封固，置37℃温箱中培养2-4天，观察结果。接种的培养基如果是试管，可取大试管一支，底部放焦性没食子酸2克，并加玻璃珠10多粒，将培养基试管放在玻璃珠上，再沿大试管壁滴加10%氢氧化钠溶液2毫升，将大试管口用橡皮塞塞紧，置37℃温箱中培养。

③厌氧肝片肉汤接种：因肝片或肉渣内含有谷胱甘肽，可发生氧化反应而降低环境中的氧化势能，以利于厌氧菌的分离。接种方法是用接种环钩取病料，接种于培养基中，在37℃温箱中培养2-4天，观察结果。